Москва - 2008
Авторы: докт. мед. наук А.Г.Колес ик, канд. техн. наук А.М.Капустин, канд. мед. наук Т.В.Кулаженко, канд. биол. наук М.Ю.Жит ов, канд. мед. наук Л.Е.Серебрякова, И.А.Степанова, В.Г.Серебренникова.
Тест определения индивидуальной чувствительности организма к фториду заключается в том, что известный индекс лекарственной чувствительности, предложенный С.М.Демьяненко (1988), модифицируется дополнительным определением суточного выведения фторида после физиологической нагрузки. Тест позволяет выделить группу лиц с повышенной чувствительностью, у которых фторид можно применять в высоких дозах только на фоне корригирующей терапии (антигистаминные препараты) с целью дифференцированного подхода к использованию препаратов фтора для профилактики флюороза зубов.
Медицинская технология предназначена для стоматологов-терапевтов, детских стоматологов, врачей клинической лабораторной диагностики, педиатров, врачей по общей гигиене, врачей по санитарно-гигиеническим лабораторным исследованиям.
Рецензенты: вице-президент Стоматологической ассоциации России, академик РАМН, проф. В.К. Леонтьев; зав. кафедрой факультетской терапевтической стомато логии ГОУ ВПО "МГМСУ Росздрава" проф. Ю.М. Максимовский.
© ФГУ "ЦНИИС и ЧЛХ Росмедтехнологий", 2008
Применение фторида для профилактики кариеса зубов можно отнести к категории уникальных явлений в медицине. Его присутствие необходимо для формирования кислотоустойчивых кристаллов фторапатита эмали зубов. Известно также, что неорганические соединения фтора в больших концентрациях токсичны, а разница между порогами полезной и токсичной концентраций небольшая.
Постоянное эндогенное поступление фторида для поддержания резистентности эма- ли зубов требует регулярного контроля и соблюдения мер предосторожности, так как слишком значительное повышение его поступления в организм приводит к нежелательным последствиям. Суточные дозировки соединений фтора, приводимые в литературе, широко варьируют; были разработаны усредненные нормы. Необходи мо отметить, что прием фторида в соответствии с этими нормами не всегда оказывает одинаковое действие на организм человека, так как взятое и рассчитан ное для "нормы" состояние "относительного здоровья" у индивидуума может меняться под действием разных факторов окружающей и внутренней среды, изменяя, таким образом, чувствительность к вводимым препаратам. Поэтому проблема поиска и разработки надежного метода контроля поступления фторида в количествах, эффективных для профилактики кариеса зубов, и в то же время безопасных для общего здоровья человека остается актуальной задачей стоматологии.
В существующих на сегодняшний день методиках определения обеспеченности фторидом определяется только его концентрация в жидкостях и тканях организма, однако, сообщается о том, как эта концентрация оказывает на него влияние. Задачей исследования являлось получение дополнительной информации о действии фторида на организм: адекватна ли определенная доза или чрезмерна, дает ли побочные эффекты, есть ли необходимость и на правление ее корректировки у конкретного человека. В этом аспекте особое значение имеет определение индивидуальной чувствительности организма человека к соединениям фтора, а при наличии повышенной чувствительности существенную роль может сыграть еще и уровень задержки фторида в организме, подверженный также индивидуальным колебаниям. В качестве ориентировочного критерия для всех возрастных групп может, по данным физиологов, считаться 50% уровень экскреции фторида. При его снижении может создаться ситуация избыточного накопления, поэтому этот параметр должен быть включен в предлагаемый тест, а наиболее точно и просто уровень экскреции можно определить с использованием физиологической нагрузки.
Предложенный тест определения индивидуальной чувствительности основан на модифицированном индексе лекарственной чувствительности (ИЛЧ), предложенный С.М.Демьяненко (1988), уровни которого адаптированы к реально встречающимся концентрациям фторида в организме человека, но в случае выявления повышенной чувствительности дополнительно проводится также определение суточной экскреции фторида после физиологиче¬ской нагрузки, что позволяет учесть уровень задержки фторида у конкретного человека и дать рекомендации по индивидуальному приему препаратов фтора для предупреждения его передозировки и профилактики флюороза зубов и костей.
♦ При подозрении на передозировку поступления фторида.
♦ При токсикологических исследованиях.
■ острые воспалительные заболевания почек;
■ заболевания, сопровождающиеся повышенной кровоточивостью;
■ флебиты.
ТЕХНОЛОГИИ
♦ Флюориметр, фотометр, хемилюминометр ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т.
Регистрационное удостоверение МЗ РФ № 29/07020299/0183-00 от
20.04.2000 г.
Медикаменты
Натрия фторид, таблетки для рассасывания (для детей), 2,2 мг натрия фторида. Регистрационное удостоверение ФС № П N016088/01 от 03.11.2006 г.
Реактивы
Натрия фторид NaF, ч. д. а.; ГОСТ 44632-76. Натрия хлорид NаСl, х. ч.; ГОСТ 4233-77.
Натрия ацетат, тригидрат СН3СО ОNa x ЗН2O, х. ч.; ГОСТ 199-78. Натрия гидроксид Na OH, х.ч.; ГОСТ 4328-00.
Натрия цитрат, гидрат Nа3C6H5О7 x 5Н2O, ч. д. а.; ГОСТ 22280-05. Калия хлорид КСl, х. ч.; ГОСТ 4234-99. Кислота соляная HCl, х.ч.; ГОСТ 4778-00. Кислота уксусная, х.; ГОСТ 61-75. Кислота хлорная HClO4, х.ч.; ТУ 6-09-2878. Спирт этиловый ректификованный, 96о; ГОСТ 5962-02. Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72, затем деминерализованная с содержанием фторида менее 10 мкг/дм3 (0,5х10-6 М).
Тест определения индивидуальной чувствительности организма к фториду состоит из 2 диагностических критериев и проводится в 2 стадии. Вначале определяют индекс лекарственной чувствительности, предложенный С.М. Демьяненко, (1988) путем оценки степени повреждающего действия фторида натрия на эритроциты in vitro. В результате клеточной деструкции реализуется выброс во вне клеточную среду биологически активных веществ, которые потенцируют дальнейшее повреждение эритроцитов и увеличение в ней концентрации реагирующих компонентов. О степени активности последних судят по скорости реакции кислотного гемолиза в присутствии 0,002 М раствора соляной кислоты в изотоническом растворе натрия хлорида.
Таким образом, на первом этапе в ходе инкубации in vitro нативной крови с фторидом происходит скрытый процесс модуляции резистентности, а на втором - при внесении в инкубационную смесь раствора соляной кислоты в качестве инициатора гемолиза - этот процесс проявляется сдвигом скорости реакции кислотного гемолиза.
В качестве первоначального критерия оценки индивидуальной чувствительности используют 2 уровня индекса лекарственной чувствительности. При ИЛЧ>0,95 на концентрацию фторида 3х10-5 М имеет место удовлетвори¬тельная переносимость и его препараты можно применять без ограничений; при ИЛЧ=0,65÷0,95 использование возможно на фоне корригирующей терапии (антигистаминные препараты). Не выявлено лиц, у которых применение соединений фтора полностью противопоказано (ИЛЧ Вторым уточнительным диагностическим критерием при ИЛЧ=0,65÷0,95 является процент суточной экскреции фторида после физиологической нагрузки (1/3 доля максимальной суточной дозы: 1 мг для детей до 12 лет и 2 мг фторида с 13 лет и старше). Определены 2 уровня чувствительности: оптимальный (экскреция фторида составляет более 50%) и высокий (при снижении экскреции фторида ниже 50%). Если у индивидуума ИЛЧ=0,65÷0,95 и экскреция фторида после физиологической нагрузки выше 50%, применение возможно без корригирующей терапии, а если экскреция ниже 50%, то использование соединений фтора в терапевтических дозах проводят на фоне корригирующей терапии (антигистаминные препараты).
Приготовление растворов и реактивов по ГОСТ 7983-99 для определения ИЛЧ
Физиологический раствор. 8,5 г хлорида натрия NаС1 переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, перемешивают и доводят дистиллированной водой до метки. Хранят в полиэтиленовой посуде не более 1 мес.
Раствор соляной кислоты 2х103 моль/л (на 0,9% изотоническом водном растворе хлорида натрия). Раствор готовят на физиологическом ра¬створе. 0,2 мл концентрированной соляной кислоты вносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3 с 200 мл физиологического раствора, перемешивают и доводят дистиллированной водой до метки.
Раствор фторида натрия 1х10-1 моль/дм3. Раствор готовят из стандартного образца ионов фтора в соответствии с инструкцией по его применению или 1,0497 г фторида натрия, предварительно высушенного при 110°С в течение 2 ч, растворяют в мерной колбе вместимостью 250 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.
Раствор фторида натрия 3х10-3 моль/дм3. Отбирают 30 см3 раствора фторида натрия с концентрацией ионов фтора 1х10-1 моль/дм3 в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.
Раствор фторида натрия 1х10-3 моль/дм3. Отбирают 10 см3 раствора фторида натрия с концентрацией ионов фтора 1х10-1 моль/дм3 в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят дистиллированной водой до метки и перемешивают.
Градуировочные растворы фторида натрия с концентрациями ионов фтора 1х10-3÷1х10-1 моль/дм3 хранят в полиэтиленовой посуде не более 1 мес.
При подготовке проб к анализу и приготовлению растворов соблюдают следующие условия:
- температура воздуха (20±10)°С;
- атмосферное давление 630-800 мм рт. ст.;
- влажность воздуха - не более 80% при температуре 25°С.
Выполнение измерений на приборе ФЛЮОРАТ-02-АБЛФ-Т проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией на этот прибор.
Подготовка прибора к работе
Подготовку прибора к работе осуществляют в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Подготовка пробы
В качестве объекта исследования используют нативную кровь (периферическая кровь). Забор крови проводится в утреннее время, натощак. Готовят рабочую взвесь клеток путем смешивания 0,5 мл нативной крови с 49,5 мл изотонического раствора хлорида натрия, доводя оптическую плотность при красном светофильтре (630 нм) фотометра до стандартного уровня 0,7.
Измерение
Для определения контрольного уровня реакции кислотного гемолиза (РКГ) к 2 мл клеточной взвеси в наливной кювете добавляют 2 мл раствора соляной кислоты, одновременно включая секундомер. Определяют снижение экстинкции колориметрически с регистрацией процесса с помощью самопишущего милливольтметра (при его отсутствии записывать показания - с интервалами 30 с в течение 6 мин).
В опыте к 2 мл клеточной взвеси (доведенной до стандартного уровня 0,7) приливают 0,02 мл (20 мкл) раствора с исследуемой концентрацией фторида. При этом происхо ит разведение концентраций фторида в 100 раз и из приготовленных заранее растворов с концентрациями фторида 3х10-3 и 1х10-3 М создаются необходимые для исследования конечные концентрации 1х10-5 и 3х10-5 М соответственно. Инкубируют в течение 10 мин при 24°С, после чего содержимое вносят в наливную кювету, приливают 2 мл раствора соляной кислоты и регистрируют снижение экстинкции.
Величину индекса лекарственной чувствительности (ИЛЧ) определяют по формуле:
ИЛЧ =
(Вк ×То)/(Во ×Тк) , (1)где
Вк и Во - значения интенсивности контрольной и опытной реакций, То и Тк - время завершения гемолиза в контроле и опыте (в мин).
Поскольку для конкретного пациента выражение Вк/Тк приобретает значение константной величины, формула (1) может быть представлена в виде:
ИЛЧ= То×k/Во (2)
где k=Вк/Тк (3).
Оценка результатов измерения
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов 2 параллельных измерений, округленное до 2 значащих цифр после запятой.
Суточную экскрецию измеряют двукратно (до и после физиологической нагрузки, ко торая для детей до 12 лет составляет 1 мг фторида, а для лиц 13 лет и старше - 2 мг в форме выпускающихся таблеток фторида натрия соответствующей дозировки). Расчет части экскретируемой физиологической нагрузки проводят делением разности величин суточной экскреции после нагрузки и до нее на величину нагрузки и выражают ее в % (умножая на коэффициент 100).
Критерии оценки теста определения повышенной индивидуальной чувствительности к фториду
Для каждого человека предлагается определение 2 индивидуальных параметров: индекса лекарственной чувствительности и величины экскреции фторида после физиологической нагрузки (1 мг фторида у детей до 12 лет и 2 мг фторида у детей с 13 лет и взрослых). Согласно первой части этой методики выделены уровни ИЛЧ (при концентрации фторида 3х10-5М), которые целесообразно использовать в качестве критериев оценки индивидуальной лекарственной чувствительности: ИЛЧ>0,95 - удовлетворительная переносимость и ИЛЧ=0,65÷0,95 - применение возможно на фоне корригирующей терапии (антигистаминные препараты). Дополнительное определение индивидуального уровня экскреции фторида после физиологической нагрузки позволяет уточнить переносимость терапевтических доз фторида и разрешить применить фторид без корригирующей терапии, если ИЛЧ находится в интервале от 0,65 до 0,95 и экскреция фторида после физиологической нагрузки более 50%, и на фоне корригирующей терапии - если ИЛЧ находится в интервале от 0,65 до 0,95 и экскреция фторида после физиологической нагрузки менее 50%. Величины ИЛЧ
ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МЕДИЦИНСКОЙ ТЕХНОЛОГИИ
Клинико-лабораторное определение ИЛЧ проведено у 240 пациентов в возрасте от 20 до 65 лет (117 мужчин и 123 женщины) в клинике ЦНИИС, выбранных произвольно (методом рандомизации). Это были как амбулаторные пациенты в состоянии "относительного здоровья", так и пациенты, находящиеся на стационарном лечении по поводу различной патологии челюстно-лицевой области (воспаление, травма, онкология и т.д.).
Проведено 2 эксперимента. В 1 опыте на пробах крови у 145 пациентов исследовали воздействие широкого диапазона концентраций фторида - от нижних допустимых до высоких (от 2х10-6 до 1х10-4М).
Во 2 эксперименте на пробах крови у 95 пациентов изучено действие только встречающихся и допустимых в биологических жидкостях концентраций фторида от 2х10-6 до 3х10-5М. В обе группы вошли пациенты с различным статусом по состоянию их здоровья.
Как видно из данных табл. 1, величина ИЛЧ значимо снижается при увеличении концентрации фторида у лиц 1-й группы. При постоянно наблюдаемых в сыворотке крови концентрациях фторида (2-4х10-6 М) встречаемость уровня ИЛЧ=0,65÷0,95 возрастает от 0 (при 2х10-6 М) до 4,1% (при 4х10-6 М). При более высокой концентрации 1х10-5М у 6,9% исследованных лиц появляются уровни ИЛЧ=0,65÷0,95. При временно наблюдаемых (примерно в течение 6 ч) подъемах концентраций фторида в сыворотке крови после разового приема верхних физиологических суточных доз (4,5-6 мг для человека массой 60 кг) до уровня 3х10-5М у 13,8% исследованных лиц появляются уровни ИЛЧ=0,65÷0,95. При еще более высокой концентрации фторида (1х10-4М) наблюдается снижение ИЛЧ до уровня 0,92; число лиц, проявляющих повышенную чувствительность к вышеуказанной концентрации, составило 48,3% соответственно. Частота встречаемости параметра ИЛЧ
Таблица 1. ИЛЧ при воздействии концентраций фторида от 2х10 до 1х10- М (n=145, М±a)
|
Параметр |
Концентрация фторида, М |
||||
|
2 х 10-6 |
4 х 10-6 |
1 х 10-5 |
3 х 10-5 |
1 х 10-4 |
|
|
ИЛЧ |
0,99 ± 0,05 |
0,97 ± 0,06 |
0,96 ± 0,07 |
0,95 ± 0,07 |
0,91 ± 0,09 |
|
ИЛЧ=0,65÷ 0,95 (% лиц) |
0 |
4,1* |
6,9* |
13,8* |
48,3* |
|
ИЛЧ |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
Примечание. *Различие в действии концентраций фторида при ИЛЧ=0,65÷0,95 до -стоверно по сравнению с концентрацией 2х10-6 при р
При исследованиях лиц 2-й группы была исключена самая высокая концентрация фторида (1х10-4М - 1,9 мг/см3), как не встречающаяся в жидкостях человека и не несущая содержательной информации о повышенной чувствительности к фториду. Исследования, проведенные во 2-й группе (табл. 2), показали, что ИЛЧ с увеличением концентрации фторида также уменьшается как у здоровых, так и у лиц с наличием соматической патологии. При постоянно наблюдаемых в сыворотке крови концентрациях фторида (2-4х10-6М) встречаемость уровня ИЛЧ=0,65÷0,95 возрастает от 0 (при 2х10-6 М) до 3,2% (при 4х10-6М). Показатели чувствительности при физиологической концентрации фторида (4х10-6М) были близки (3,2%) таковым из первой части исследования (4,4%). При более высокой и менее часто встречаемой концентрации 1х10 -5 М у 5,3% исследованных лиц появляются уровни ИЛЧ=0,65÷0,95 по сравнению с величиной 6,7% в 1-м эксперименте. Показатели чувствительности при верхней физиологи¬ческой концентрации фторида (3х10-5М) были близки (10,5%) таковым из первой части исследования (13,3%). Частота встречаемости параметра ИЛЧ
Таблица 2. ИЛЧ при воздействии концентраций фторида от 2х10-6 до 3х10-5 М (n=95, М±σ)
|
Параметр |
Концентрация |
фторида, М |
||
|
2 х 10-6 |
4 х 10-6 |
1 х 10-5 |
3 х 10-5 |
|
|
ИЛЧ |
0,98 ± 0,06 |
0,96 ± 0,07 |
0,95 ± 0,08 |
0,95 ± 0,08 |
|
ИЛЧ=0,65÷ 0,95 (% лиц) |
0 |
3,2* |
5,3* |
10,5* |
|
ИЛЧ |
0 |
0 |
0 |
0 |
Примечание. *Различие в действии концентраций фторида при ИЛЧ=0,65÷0,95 достоверно по сравнению с концентрацией 2х10-6М при р
Таким образом, даже при физиологических концентрациях, определяемых в сыворотке крови (4х10-6М) в 3,2-4,1% случаев (средневзвешенная ве¬личина - 3,7%), могут наблюдаться проявления повышенной чувствительно¬сти к фториду, а при верхних физиологических концентрациях (3х10-5М) частота их встречаемости возрастает до 10,5-13,8% (средневзвешенная вели¬чина - 12,5%), а в этих случаях уже требуется проведение корректирующей терапии или снижение его терапевтической дозы.
Именно в этой последней подгруппе обследованных лиц (имеющая ИЛЧ=0,65÷0,95 при верхних физиологических концентрациях фторида 3х10-5 М), которая составляет 12,5% всех обследованных, требуется уточне¬ние величины фактической экскреции фторида с мочой, так как увеличение задержки фторида в организме может сыграть дополнительную отрицатель¬ную роль. Из данных литературы по физиологии такой критической точкой является 50% уровень экскреции. Результаты определения уровней экскре¬ции фторида у всех 240 участников исследования после физиологической на¬грузки фторидом (2 мг для всех обследованных), проведенных в соответствии с усовершенствованной медицинской технологией № ФС 2006/018-У, приве-де ны в табл. 3.
Таблица 3. Зависимость параметров экскреции фторида после физиологической нагрузки от величины ИЛЧ при воздействии концентраций фторида 3х10-5М (n=240)
Как показывают данные табл. 3, у 1/4 лиц, имеющих повышенную чув¬ствительность к фториду (ИЛЧ=0,65÷0,95), наблюдается повышенная его эк¬скреция (3,3% всех обследованных), что дает возможность отнести их к пред¬ыдущей группе, не имеющих ограничений в применении терапевтических доз фторида. У 3/4 лиц этой же подгруппы, имеющих повышенную чувствитель¬ность к фториду (ИЛЧ=0,65÷0,95), наблюдается пониженная его экскреция (9,2% всех обследованных), что требует особого внимания, так как именно у этих лиц могут создаться условия задержки, накопления фторида в организме и повышения его концентрации во внутренних жидких средах организма со всеми вытекающими из этого последствиями. Дополнительное определение индивидуального уровня экскреции фторида после физиологической нагруз¬ки позволяет уточнить переносимость терапевтических доз фторида и разре¬шить на фоне корригирующей терапии применение фторида, если ИЛЧ нахо¬дится в интервале от 0,65 до 0,95 и экскреция фторида после физиологической на грузки менее 50%.
Не было выявлено лиц, у которых применение соединений фтора противопоказано (ИЛЧ
Предложенная методика достаточно проста, не требует дефицитных реактивов и забора большого количества крови (капиллярная кровь) и мо жет быть рекомендована для широкого применения для оценки индивидуальной чувствительности и других препаратов. При внедрении этой методики в практику можно исключить высокие дозы фторида и при испытаниях ограничиться 2 концентрациями его: 1х10-5М и 3х10-5М, причем определяющей является верхняя физиологическая концентрация 3х10-5М.
Контроль индивидуальной чувствительности к соединениям фтора повысит эффективность и безопасность их применения в терапевтических целях, например, для профилактики и лечения сенильного остеопороза.
На основе впервые полученных данных можно сделать следующее заключение.
Лиц, у которых применение соединений фтора полностью противопоказано (ИЛЧ0,95 переносимость фторида считается удовлетворительной и его пре¬параты можно применять без ограничений (87,5% обследованных лиц). Если у индивидуума ИЛЧ=0,65÷0,95 и экскреция фторида после физиологической нагрузки выше 50% (3,3% обследованных), применение возможно и без кор¬ригирующей терапии, а если экскреция ниже 50% (8,6% обследованных) - на фоне корригирующей терапии (антигистаминные препараты).
Таким образом, суммарно у 90,8 (87,5+3,3)% обследованных можно без ограничений применять препараты фтора в физиологических и терапевтиче ских дозах. Информация о существовании группы лиц (9,2% всех обследованных), у которых использование препаратов фтора должно проходить на фоне корригирующей терапии (антигистаминные препараты), также была получена впервые. Это позволит дать обоснованные рекомендации по индивидуальному приему соединений фтора для профилактики кариеса зубов и предупреж